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AMEKO试剂:超敏ECL化学发光底物

产品时间:2024-11-13

简要描述:

AMEKO试剂:超敏ECL化学发光底物
主营品牌:Lanso、Ameko、Sigma、Amresco、Abcam、Spectrum、Axygen、Corning、Gibco、Hyclone、Invitrogen、Millipore、Roche、Aladdin、Tci、Merck、Qiagen、Supelco、Vetec、Sab、Oxoid

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ECL化学发光底物(超敏)

产品编号

产品名称

规格

RC52314

ECL化学发光底物(超敏)

100 ml

RC52314

ECL化学发光底物(超敏)

500ml

产品简介:

 ECL超敏发光液用于检测直接或间接标记辣根过氧化物酶HRP的抗体及其关联的抗原。

产品组份:

产品编号

产品名称

规格

RC52314

    增强型发光液   A液

50ml/250ml

RC52314

    稳定剂   B 液

50ml/250ml

 

用途:用于HRP标记抗体的Western Blot和HRP标记探针的核酸杂交。

产品特点:

1、灵敏度高:可检测低皮克级的蛋白;

2、信号持续时间长:光信号持续时间长达5小时;

3、稳定试剂:工作液在24小时内保持稳定;

4、成像方法:适用于CCD或激光凝胶成像仪;

5、价格经济:针对稀释的抗体浓度条件进行了优化,节省抗体:

一抗:以1 µg/mL储存液稀释1:1,000至1:4,000倍

二抗:以1 µg/mL储存液稀释1:2,000至1:5,000倍

6、简单易用:可替代其它公司的ECL发光底物,操作步骤无需进行特别优化;

使用方法:

1、执行常规SDS-PAGE、转膜和Western Blot步骤。注意用HRP标记IgG或用一抗-链亲和素-生物/素-HRP夹法。

2、 Western Blot最后一次洗膜的同时新鲜配制发光工作液:分别取等体积的溶液A和B,放入干净容器中混合。建议立即使用工作液,室温放置数小时后仍可使用但灵敏度略有降低。

3、 用镊子取出膜,搭在滤纸上沥干洗液但勿使膜干燥。将膜浸入发光工作液(0.125mL发光工作液/cm2膜)中,与发光工作液充分接触。室温孵育3分钟,准备立即压片曝光。孵育时间过长不会增加灵敏度,有时还会导致曝光条带异常。发光过程的本质是酶促反应,使用过少的发光工作液不利反应进行,也会导致膜上条带曝光不均和明显降低灵敏度。为达节约目的可将膜剪小但勿降低发光液用量。

4、 用镊子夹起膜,搭在滤纸上沥干发光工作液。但勿洗去发光液。

5、 打开X光胶片暗盒,在暗盒内表面铺一张面积大于膜的保鲜膜。将Western Blot膜贴在保鲜膜上,将保鲜膜折起来包裹Western Blot膜,去除气泡和皱褶,可剪去边缘部多余的保鲜膜。用滤纸吸去多余的发光工作液。用胶带将覆盖Western Blot膜的保鲜膜固定在暗盒内,蛋白带面向上。

6、 暗房内压X光胶片,分别曝光不同的时间,如数秒到数分钟。显影冲洗。建议第一次曝光 60 秒,之后可调整曝光时间以达到最佳结果。化学发光反应在底物孵育后的前 5-30 min期间是强烈的。这一反应可以持续几个小时,但强度会随时间下降,如有底物孵育后较长时间后曝光,曝光时间可能需要延长以获得较强信号。          

注意事项:

(1)步骤1~5可在日光灯下操作;但发光液曝露于强光下时间过久灵敏度可能略有降低,移到暗房操作可避免之。

(2)长时间曝光或蛋白过量,将加深背景并使条带强弱变化失去线性关系。曝光不足则条带模糊。

(3)发光工作液孵育约3分钟后膜上的条带发光。强条带发光在暗房中肉眼可见,低丰度蛋白条带发光较弱甚至肉眼不可见但可使X光胶片曝光。肉眼不可见的荧光实际上可持续数小时并使X光胶片感光,因而弱带可曝光1-10小时。如果曝光后条带不佳,可用洗膜缓冲液洗膜,重新孵育二抗,然后重新用ECL发光和曝光。

(4)由于超敏发光液极其灵敏,建议按照推荐比例稀释抗体。抗体浓度过高将造成高背景或没有条带,导致失败。

(5)某些保鲜膜包裹印迹膜时可能会淬灭荧光,应选择高质量保鲜膜。

(6)使用肉眼可见的预染色蛋白Marker和荧光-放射自显影曝光标签可精确确定胶片上条带的位置和大小。

(7)叠氮钠是 HRP 的抑制物,不要使用叠氮钠作为缓冲液的防腐剂。

问题解答:

问题

可能问题

解决方案

胶片上有反转像(即黑色背景,白色带)

 

系统中HRP过多

 

将HRP标记二抗稀释至少10倍

膜上有褐色或黄色带

印记在暗室中发光

信号持续时间少于8小时

 

信号弱或无信号

系统中过多的HRP耗尽了底物并导致信号迅速衰减

将HRP标记二抗稀释至少10倍

抗原或抗体的量不足

增加抗体或抗原的量

蛋白质转移率低

优化转印

HRP   或底物活性低

见下文注释

 

 

高背景

系统中   HRP 过多

将HRP标记二抗稀释至少 10 倍

封闭不充分

优化封闭条件

封闭式机不合适

尝试一种不同的封闭试剂

洗涤不充分

增加洗涤时间、次数或洗涤缓冲液体积

胶片过度曝光

缩短曝光时间或使用背景消除剂

抗原或抗体的浓度太高

减少抗体或抗原的量

 

蛋白质条内有斑点

蛋白质转膜效率低

优化转印流程

膜的水化不均匀

按照制造商建议适度的使膜水化

胶片与膜之间存在气泡

在胶片曝光前,去除气泡

胶片上背景有斑点

HRP   标记二抗中存在聚集物

使用   0.2um 的过滤器

非特异性条带

系统中   HRP 过多

将HRP标记二抗稀释至少10倍。

SDS   导致的蛋白非特异性结合

在检测过程中不使用   SDS

*为检测系统活性,在暗室中,在一个清洁试管中制备1-2ml工作液。关闭灯,添加1ul未稀释的HRP标记二抗工作液。该溶液应当立即发出蓝色光,蓝光信号在随后的几分钟渐淡。

AMEKO试剂:超敏ECL化学发光底物

AMEKO试剂:超敏ECL化学发光底物

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