ELISA试剂盒实验中每一个步骤都尤为重要，细节不容忽视，它是实验成功的关键与否；在这里方便各位了解，更好的完成实验，对ELISA试剂盒的实验原理和操作步骤做出以下分析，供大家参考：

 

　　实验原理：

　　用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗该指标抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗该指标抗体、HRP标记的亲和素，经过*洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成的黄色。颜色的深浅和样品中的该指标呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

 

　　实验前的准备工作：

　　1、准备好所有实验额外所需物品，如试管 吸头 移液器 离心机等；

　　2、确定试剂盒在有效期内；

　　3、仔细阅读说明书；

　　4、按说明书确定所有试剂齐全；

　　5、标本制备要规范，每份标本体积要按2-3个复孔以上的量制备，尽量分装做备份；

　　6、根据检测标本数量确定所需试剂的量；

　　7、按说明书将所用试剂盒平衡至室温，配制所需试剂。

 

　　ELISA试剂盒的操作步骤：

　　1、使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差；

　　2、根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。标本用标本稀释液1：1稀释后加入50ul于反应孔内；

　　3、加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育1小时；

　　4、甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次；

　　5、每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟；

　　6、甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次；

　　7、每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育10分钟。避免光照；

　　8、取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果；

　　9、在450nm波长处测定各孔的OD值。