（ELISA测定操作规程（以小鼠TNF-a为例）

一、原理与意义

通过抗原和抗体在体外特异结合后出现的各种现象,对样品中的抗原或抗体进行定性和定量检测。本实验采用双抗体夹心ABC-ELISA法,用抗小鼠TNF-a单抗包被于酶标板上,标准品和样品中的TNF-a与单抗结合,加入生物素化的抗小鼠TNF-a抗体,形成免疫复合物连接在板上,辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素（Streptavidin）与生物素结合,加入酶底物邻苯二胺（OPD）,出现黄色,加终止液浓硫酸,颜色变深,在492nm处测OD值,TNF-a浓度与OD值成正比,可通过绘制标准曲线求出标本中TNF-a浓度。它是样品中蛋白质含量检测的定性和定量方法。

二、试剂盒的组成

96/48微孔板（1块,已包被抗小鼠TNF-a单抗）、样品稀释液（1瓶）、*抗体工作液（1瓶）、酶标抗体工作液（1瓶）、底物稀释液（1瓶）、终止液（1瓶）、洗涤液（20×,1瓶）、标准品（2000 pg/ml,2管,冻干粉）、OPD片（3片）、坐标纸（1张）。

三、实验准备工作

1、试剂配制:洗涤液按1:20三蒸水稀释;标准品在用前每管加入200 ?l蒸馏水溶解即可（具体见说明书）;底物工作液应在显色前5-10 min将OPD片放入底物稀释液中溶解,每片加5 ml液。

2、标本收集:采集血清或体液尽早检测,2~8 ℃保存一天需更长时间须冷冻（-20℃）保存,避免反复冻融;组织（胎肝、胎脑等）实验前一天组织匀浆,用90%体积RIPA裂解液（PH 8.0,50 mM Tris HCl、1% NP-40、,0.25% sodium deoxycholate、150 mM NaCl、1 mM EDTA）和10%体积的10 mM PMSF进行组织匀浆（10%）,冰上裂解30 min,12000×20min后取上清,4℃待用。

3、器材准备:酶标仪、37 ℃恒温烤箱、滤纸、托盘、量筒、烧杯、各种规格的移液器、离心管、管架和废液缸等。三蒸水自备。

四、操作步骤

1、设立标准孔8孔（根据样品蛋白浓度可调整为6孔）,每孔中先各加入样品稀释液100 ul,*孔再加标准品100 ul,混匀后用移液器吸出100 ul,移至第二孔,如此反复作对倍稀释至第7孔,zui后,从第7孔中吸出100 ul弃去,使之体积均为100 ul。第8孔为空白对照。

2、加样:待测样品孔中每孔各加入待测样品100ul。

3、将反应板置于37 ℃×120 min。

4、洗板:用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次,向滤纸上扣干。

5、每孔中加入*抗体工作液50ul。

6、将反应板充分混匀后置37 ℃×60 min。

7、洗板:用洗涤液将反应板充分洗涤4~6次,向滤纸上扣干。

8、每孔加酶标抗体工作液100ul。

9、将反应板置于37 ℃ 120 min。

10、洗板:用洗涤液将反应板充分洗涤4~6次,向滤纸上扣干。

11、每孔中加入底物工作液100ul, 置于37 ℃暗处反应5~10 min。

12、每孔中加入50ul终止液混匀。

13、用酶标仪在492 nm处测吸光值。

五、计算结果与判断

1、以标准品 1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、0 pg/ml之OD值在半对数纸上作图,画出标准曲线。

2、所有OD值都应减去空白管值后再计算。

根据样品OD值在该标准曲线图上查出或根据标准曲线公式换算出相应样品中TNF-a含量。

六、注意事项

1、以上标准孔及待查样品均建议做复孔,每次测定均要做标准孔。

2、本试剂盒宜置-20 ℃冷藏保存。

3、本试剂盒取出的试剂在室温（20~25 ℃）环境下使用,溶液应轻轻摇匀后使用。

4、本试剂盒含2M硫酸,不要将它与含*的废物混在一起。

5、板条开封后剩余板条要再封好,保持板条干燥。

6、避免交叉污染。如洗涤时向样品待测蛋白含量可能高的一侧倾倒。

7、提前24 h打开烤箱预热。

8、底物工作液应在显色前5~10 min配制。若配制时间过长,会变质。

9、甩尽孔内液体,每孔加350 ul左右洗涤液,静止30 s后甩尽。尤其加抗体工作液或底物时尽量弄干孔内液体。且孵育过程中要盖住各反应孔,防止液体恢复。

10、尽量防止样品待测蛋白浓度过高而出现酶标仪显示out。当酶标仪测定值出现许多out时,可通过稀释一定倍数后用可见光分光计测定,所有孔均同时测定。