一、单相琼脂扩散试验
原理
一种定量试验，将一定量的抗体混合于琼脂内，倾注于玻片上，凝固后，在琼脂层上打孔，再将抗原加入孔中，使其向四周扩散。抗原抗体复合物形成的沉淀环直径与抗原的浓度成正比。如事先用不同浓度的标准抗原制成标准曲线，则未知标本中的抗原含量即可从标准曲线中求出。本试验主要用于检查标本中各种免疫球蛋白和血清IgG含量。
材料
１．抗体：羊抗人IgG单价抗血清。
２．抗原：待检血清。
３．３％生理盐水琼脂、生理盐水、载玻片、直径３mm打孔器、小三角烧瓶、毛细滴管、湿盒。
方法
1、制备含抗体的琼脂板
取羊抗人IgG单价抗血清一瓶（效价1：80），量取0.3ml于一小三角烧瓶中，加生理盐水11.7ml（40倍稀释混匀，置56℃水浴中恒温2~3分钟）。
取3%生理盐水琼脂一管，隔水加热使溶，然后置56℃水浴中，待琼脂温度降至56℃时，立即加入等量1：40稀释抗血清，迅速轻轻混匀，勿使产生气泡，迅速倾入载玻片上，每片3.5ml，待凝固后打孔。如下图所示。
2、稀释待检血清
将待检血清用生理盐水作40倍稀释，
3、打孔、加样
每份检样加两孔，加满（但不要溢出），加样时毛细滴管不要划破琼脂。
4、温育
将琼脂板置搪瓷盒，垫湿纱布或海绵以防干燥，37℃恒温箱24h。
结果观察与分析
测量并求出每份检样两孔的沉淀环平均直径，按照标准曲线求出IgG含量。
标准抗原浓度（mg/100ml）
标准曲线图
二、双向琼脂扩散试验
原理
常用于定性检测，也可用于半定量检测。将抗原与抗体分别加入琼脂凝胶板上相邻近的小孔内，让它们相互向对方扩散。当两者在zui适当比例处相遇时，即形成一条清晰的沉淀线。根据有否出现沉淀线，可用已知的抗体鉴定未知的抗原，或用已知的抗原鉴定未知的抗体。临床常用本方法检查原发性肝癌患者血清中的甲胎蛋白，作为原发性肝癌的早期辅助诊断。
甲种胎儿蛋白（α-Fetal protein, AFP），是胎儿组织及体液中的正常组织成份。胎儿在第9周才出现此种蛋白，13~19周达高峰，到21周后逐渐下降，胎儿出生后该蛋白即行消失或含量甚微，普通试验方法检查不出，而肝癌病人及个别卵巢癌或睾丸癌病人的血清检出有此种蛋白。
材料
1．抗AFP血清、已知肝癌病人AFP阳性血清、待检病人血清。
2．1.2%琼脂（用生理盐水配成）。
3．载玻片、毛细吸管、湿盒。
方法
1．制备琼脂玻片 将已知加热溶化的1.2%琼脂3.5ml，迅速倾入载玻片上。
2．打孔 待凝固后用打孔器按下图样打孔。（孔径3mm，孔距4mm）
2、3、5孔待检血清为AFP阳性
3．加样
以上方孔为第1孔，按顺时针方向分别称为2、3、4、5和6孔，中央孔为7孔。7孔加入抗AFP血清，1、4孔加入已知AFP阳性血清（或AFP），作为阳性对照孔；6孔加入已知AFP阴性血清，作为阴性对照孔，其余2、3、5孔为试验孔，加入待检血清。
4．温育 置湿盒室温或37℃温育12-24 h。
结果观察
1、4孔与7孔间应出现白色沉淀线（如上左图1与7，4与7），6与7孔间应不出现白色沉淀线。若2、3、5孔与7孔间出现白色沉淀线而且与阳性对照沉淀线吻合者如图中2、3、5与1、4孔间，即为实验阳性，表明待检血清中含有AFP（即AFP阳性）。如出现与阳性对照相连接，且呈枪刺状如上右图中4与5孔间，说明二者间有共同抗原成分；如出现成交叉的沉淀线如上右图3与4，则是非特异性沉淀反应，为假阳性反应，乃判为实验阴性，表明待检血清为AFP阴性。
三、 对流免疫电泳
原理 在一定条件下，胶体颗粒是带有电荷的，这些带电胶体颗粒在电的影响下发生移动。如胶体颗粒带负电，则移向阳极；反之，移向阴极。这种现象称为电泳。
对流免疫电泳是将病人血清（待检抗原）放在琼脂板阴孔内，已知抗血清（含有已知抗体）放于阳孔内，在碱性环境条件下同时进行电泳，抗原由阴极向阳极移动快，而抗体系丙种球蛋白，等电点在pH6~7之间，故带负电荷少，移动速度慢，由于电渗作用结果向阴极倒退，于是抗原抗体在电场中相遇，当两者比例适当时，则特异性抗原抗体互相结合，便形成肉眼可见的白色沉淀线。
材料
1．1%，PH8.6，0.075M巴比妥缓冲液。
2．抗AFP血清，已知AFP阳性血清，待检病人血清。
3．玻片、吸管、打孔器、毛细滴管、电泳仪等。
方法
1．将用缓冲液配制好的1.2%琼脂隔水加热溶化，趁热吸取3.5ml加于玻片上，冷凝后打孔，孔直径3毫米，二孔间距离3毫米。
2．分别从上至下向左列1、3、5孔内加入抗AFP血清；向右列2孔内加待检病人血清，4孔内加已知AFP阳性血清作为阳性对照，6孔内加已知阴性对照血清。各孔加满为度，勿使外溢，
3．将琼脂板置于电泳槽内，抗原端入阴极侧，抗体放阳极侧，二端贴上浸透电泳缓冲液的4层纱布条。
4．通电，固定电压5-6伏/厘米长，通电45~60分钟左右。
结果观察
电泳毕，关闭电源，取出琼脂板。在黑色背景上方，透过散射光线，首先观察3与4孔间（阳性对照组）、5与6孔间（阴性对照组）的白色沉淀线是否出现；再看试验孔，如孔间未出现这样的沉淀线，则该待检血清为AFP阴性血清。
四、火箭免疫电泳
原理： 火箭免疫电泳是将电泳与单向扩散结合的一种免疫技术。将抗体溶入琼脂后制板，在琼脂板的一侧打孔，加入待检样品及不同浓度的标准抗原。电泳时抗原在含定量抗体的琼脂中向正极移动，并形成浓度梯度，在适宜的部位形成火箭状的沉淀峰。沉淀峰的高度与抗原的含量成正比，故可定量测定抗原。
方法：
1、制备琼脂板
将抗体血清按一定比例与溶化好的1.5%琼脂在56℃水浴中混匀，迅速浇注成2毫米厚的琼脂板。
2、打孔
3、加样：分别加入已知浓度的标准抗原溶液和待测抗原，每孔10微升。
4、电泳：将琼脂板放入电泳槽，抗原放阴极侧，抗体放阳极侧，两端贴上浸透电泳缓冲液的4层纱布条。固定电压5~6伏/厘米长，通电时间为45~60分钟左右，观察结果。
第四节 溶血反应和补体结合试验
除凝集反应、沉淀反应外，常用的抗原抗体反应还有补体结合试验、中和试验、溶血空斑试验等。本实验介绍补体结合试验。
实验目的与原理
了解补体结合试验方法及结果分析。
补体结合试验是一种有补体参与，并以绵羊红细胞及溶血素作为指示系统的抗原抗
体反应。如被检血中有相应抗体存在，则加入相应抗原与补体后。由于抗原抗体形成复合物，可使补体与之结合，溶液中即无游离补体存在。但由于这种结合肉眼不能区别，故需加入指示系统（绵羊红细胞及其溶血素）。如补体已为试验系统抗原抗体复合物所固定，加入指示系统后，因无补体与之结合，则不发生溶血（溶血与否、肉眼易于区别），是为补体结合试验阳性，表明抗原与抗体相对应。如出现溶血。为补体结合试验阴性。表明试验系统中抗原与抗体不相应。补体末被固定，加入指示系统后。补体与之结合。从而发生溶血反应。
实验材料
1、抗原:甲型（或乙型）副伤寒杆菌菌液、2%绵羊红细胞悬液。
2、抗体:甲型（或乙型）副伤寒杆菌诊断血清。溶血素（2个单位/0.25ml）。
3、补体:琢鼠血清（2个实用单位/0.25ml）
4、其它:生理盐水、小试管、吸管等。
实验方法：
1、取5只小试管、排于试管架上并注明管号。
2、第1管加生理盐水0.4m1，再用吸管取已灭活（56℃加温30分钟）的抗体血清、lml（或被检血清）加入*管，吸吹三次使之充分混匀，然后吸出0。25ml放入第2管，两管中的血清均为1:5稀释。
3、按下表所示顺序进行操作。
实验结果
先观察有无溶血现象，各对照管结果是否正确。
溶血现象:红细胞溶解，混浊液变为红色透明液体;不溶血现象:红细胞未溶解、混浊液不变。
第2、3、4管因缺乏相应待检抗原抗体复合物，故应*溶血，第5管因仅有羊红细胞和生理盐水故不应溶血。以上均为对照管。
第1管不溶血者为补体结合反应阳性。
实验五 50%溶血试验（CH50）测定补体
50%溶血试验即求得能使50%致敏羊红细胞发生溶血的zui小量血清，然后计算出每毫升血清中补体含量。
图12由溶血素致敏洋红细胞的溶血程度与肠鼠血清（补体）量增加之间的关系
以补体量作为横坐标，溶血百分数作为纵坐标，可得到一个清晰的“S”形曲线。在50%溶血周围，线段近似一条直线。因此当补体用量稍有变动，就可对溶血程度发生很大影响。所以用50%溶血作为终点要比100%溶血更为敏感。
材料及器材
1．巴比妥缓冲液（BB，pH7.4）：使用时用蒸馏水1：5稀释
NaCl:85g 巴比妥：5.75 g 巴比妥钠：3.75 g Mgcl2：1.017g Cacl2：0.166 g 蒸馏水2000ml，过滤，4℃保存。用时用此液1份加4份蒸馏水，当日配用。
2．2％SRBC悬液：新鲜脱纤维羊血，10倍NS洗3次。前两次每次2000rpm*5min，zui后一次2500rpm*10min，取羊红细胞用BB液配成2％SRBC悬液
3．溶血素（2U）、被检血清（新鲜豚鼠血清）、水平离心机、水浴箱、721型分光光度计、
4、制备50％溶血标准管：取2％SRBC悬液2ml加蒸馏水8ml，SRBC全部溶解，为100％全溶管。取全溶管上清液2.5 ml加BB液2.5 ml，混匀，即为50％溶血标准管。
方法：
1．制备1：20血清 抽取静脉血于试管中，室温下静置，分离血清（2小时内），用BB液稀释为1：20。
２．制备50％溶血标准管
３．补体CH50单位测定：取试管10支，分别编号1、2、3。。。。。10，按下表加样
⑴按下表加样：
结果判断：
取各管先与50％溶血标准管初步目视比较，选择与标准管相接近的两管，用721分光光度计在波长542nm读T值，求出两者中更加接近标准管透光率的一管，根据此管中加入稀释血清的量，按下式求出总补体值。计算每ml血清中补体活性（U/ml）：
注意事项：
1、 待测标本应无溶血、无污染、无乳糜血。实验器材应清洁。
2、 缓冲液、致敏羊红细胞均应新鲜配置。
3、 受检血清必须新鲜，如放置2小时以上，会使补体活性下降。
4、 补体的溶血活性受多种因素的影响，例羊红细胞浓度及溶血素的量等。
临床意义：本法测定补体的正常参考值：50～100 U/ml。在急性炎症、感染、组织损伤（如风湿热急性期、结节性动脉周围炎、皮肌炎、伤寒和多发性关节炎）、肿瘤、骨髓瘤等时，常可见补体含量升高，使CH50偏高；低补体血症多见于与免疫有关的疾病，系病程中消耗了补体所致，如：急性肾小球肾炎、膜增殖性肾小球肾炎、
