一、基础试剂与耗材

1. 胶原酶粉末（根据组织选型：

· 软组织 / 脂肪：Ⅰ 型

· 骨骼、软骨：Ⅱ 型

· 胰岛、肿瘤、上皮：Ⅳ 型）

1. 基础溶剂：无钙镁 PBS / DMEM/F12 / HBSS（无菌，预冷）

2. 辅助添加剂（按需）：BSA、HEPES、DNase I、青霉素 - 链霉素

3. 无菌滤器：0.22μm 水系滤膜

二、常用工作浓度（临床 / 细胞实验）

1. 储存液（10× 母液，1000 U/mL）

配方：1000 U 胶原酶粉末 + 1 mL 无菌 HBSS / 无钙 PBS 例：配 10 mL 母液 胶原酶粉末：10000 U 溶剂：10 mL 无钙镁 HBSS 操作：

1. 冰上避光溶解，轻柔吹打，禁止剧烈震荡（酶易失活）

2. 0.22μm 滤器过滤除菌

3. 分装 1 mL / 管，-20℃避光冻存，避免反复冻融

2. 常规工作液（1×，100 U/mL）

取 1 份 10× 储存液 + 9 份基础培养基 / HBSS 终浓度：100 U/mL，适用于脂肪、肝、皮下软组织消化

3. 低浓度工作液（50 U/mL，娇嫩组织：胰岛、乳腺上皮）

1 份 10× 母液 + 19 份缓冲液

三、完整分步配制流程（无菌操作，全程冰浴）

1. 预冷缓冲液 无钙镁 HBSS 37℃预热或 4℃冰浴，含钙镁会抑制胶原酶活性。

2. 称量溶解 按目标单位称取胶原酶，缓慢加入缓冲液，冰上静置 10–20 min 自然溶解，轻吹打混匀。

禁止涡旋高速震荡，蛋白变性失活。

1. 添加保护剂（推荐） 每 10 mL 溶液加 10 mg BSA（0.1%），稳定酶活性，减少细胞损伤； 如需减少细胞团块：加 DNase I 至终浓度 10–20 μg/mL。

2. 除菌过滤 用 0.22μm 一次性滤器负压过滤，胶原酶不能高压灭菌（高温失活）。

3. 分装保存 母液分装冻存；工作液现配现用，4℃可存放 24 h，不建议长期冷藏。

四、不同组织专用配方参考

1. 脂肪组织消化液（Ⅰ 型胶原酶）

HBSS + 100 U/mL Ⅰ 型胶原酶 + 1% BSA + 1% 双抗 37℃水浴摇床消化 30–60 min

2. 软骨 / 骨组织（Ⅱ 型胶原酶）

DMEM + 150 U/mL Ⅱ 型胶原酶 + 0.5% BSA，消化 2–4 h

3. 胰岛分离（Ⅳ 型胶原酶）

HBSS + 50–80 U/mL Ⅳ 型胶原酶 + HEPES 10 mM，冰上灌注、37℃短时消化

五、关键注意事项

1. 温度：胶原酶 37℃活性最高，溶解、保存全程低温；

2. 离子：无钙镁缓冲液配制，Ca²⁺、Mg²⁺降低酶活；

3. 灭活：消化结束后，加含血清培养基中和（血清蛋白结合胶原酶终止反应）；

4. 失效：冻融＞3 次、室温放置超过 2 h 酶活性大幅下降，建议现配工作液；

5. 避光：胶原酶粉末及溶液避光保存，光照加速失活。

六、简易快速配液示例（10 mL 100 U/mL 工作液）

1. 取 1 mL 1000 U/mL 胶原酶母液；

2. 加入 9 mL 无菌无钙 HBSS；

3. 加入 100 mg BSA 充分溶解；

4. 0.22μm 过滤，即刻用于组织消化。