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关于蛋白质缀合的方案你了解多少?
  • 发布日期:2019-04-04      浏览次数:281
    • 关于蛋白质缀合的简捷方案你了解多少?

      以下是使用SMCC和DTT详细说明PE-蛋白质缀合的方案,供参考。

      注意:该方案使用IgG(MW:150kDa)作为其缀合蛋白,但是其他蛋白质可以用适当修饰的量替代。

       

      PE准备

      注意:如果PE作为溶液(通常为硫酸铵)储存,则必须首先进行离心分离。离心并弃去上清液,然后在PBS中以与原溶液相同的浓度重建沉淀物。

      如果PE以固体形式储存,立即悬浮在PBS中。

      对于计划结合的每mg IgG,使用3.5 mg PE。

      1.将PE溶液透析,每1升PE对1升PBS进行透析。重复一次。

      2.对每升PE的1升透析缓冲液*透析PE溶液。

      3.通过测量280,565和620 nm处的吸光度来确保PE溶液的纯度。得到的565 / 620nm读数大于50的比率是藻蓝蛋白去除的指标,并且565/280比率大于5表明溶液的进一步纯度。

       

      PE衍生化(SMCC-PE)

      1.在其用于以下步骤和缀合之前,立即在DMSO中制备10mg / mL SMCC原液。

      2.每mg PE将11μlSMCC溶液加入到步骤1b产生的PE溶液中。将溶液包裹在铝中,孵育1小时,旋转。

      3.用交换缓冲液*平衡凝胶过滤柱,并将前一步骤中的衍生化PE通过其上。

       

      减少IgG

      1.在蒸馏水中制备1M DTT(15.4 mg /100μl)溶液。

      2.在4mg / mL或更高的适当缓冲液中制备IgG。

      3.通过在混合的同时每mL IgG溶液添加20μlDTT原液来产生20mM IgG溶液。在没有额外混合的情况下,站立30。

      4.用交换缓冲液平衡过滤柱,并将还原的IgG通过。从柱中收集0.25mL馏分并以大多数池合并。

      一旦完成该步骤,就完成以下结合,并且完成步骤2(同时)。

       

      共轭

      1.每mg还原的IgG溶液加入3.2mg SMCC-PE。用铝包裹并在室温下旋转1小时。

      2.准备10 mg NEM在1 mL DMSO中的溶液。

      3.每mg IgG向IgG溶液中加入34μg。再次包裹铝并在室温下旋转20分钟。

      4.可以将终溶液透析或在柱上运行到合适的缓冲液中。

      注意:不要冻结结合物。

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