关于蛋白质缀合的简捷方案你了解多少？

以下是使用SMCC和DTT详细说明PE-蛋白质缀合的方案，供参考。

注意：该方案使用IgG（MW：150kDa）作为其缀合蛋白，但是其他蛋白质可以用适当修饰的量替代。

PE准备

注意：如果PE作为溶液（通常为硫酸铵）储存，则必须首先进行离心分离。离心并弃去上清液，然后在PBS中以与原溶液相同的浓度重建沉淀物。

如果PE以固体形式储存，立即悬浮在PBS中。

对于计划结合的每mg IgG，使用3.5 mg PE。

1.将PE溶液透析，每1升PE对1升PBS进行透析。重复一次。

2.对每升PE的1升透析缓冲液*透析PE溶液。

3.通过测量280,565和620 nm处的吸光度来确保PE溶液的纯度。得到的565 / 620nm读数大于50的比率是藻蓝蛋白去除的指标，并且565/280比率大于5表明溶液的进一步纯度。

PE衍生化（SMCC-PE）

1.在其用于以下步骤和缀合之前，立即在DMSO中制备10mg / mL SMCC原液。

2.每mg PE将11μlSMCC溶液加入到步骤1b产生的PE溶液中。将溶液包裹在铝中，孵育1小时，旋转。

3.用交换缓冲液*平衡凝胶过滤柱，并将前一步骤中的衍生化PE通过其上。

减少IgG

1.在蒸馏水中制备1M DTT（15.4 mg /100μl）溶液。

2.在4mg / mL或更高的适当缓冲液中制备IgG。

3.通过在混合的同时每mL IgG溶液添加20μlDTT原液来产生20mM IgG溶液。在没有额外混合的情况下，站立30。

4.用交换缓冲液平衡过滤柱，并将还原的IgG通过。从柱中收集0.25mL馏分并以大多数池合并。

一旦完成该步骤，就完成以下结合，并且完成步骤2（同时）。

共轭

1.每mg还原的IgG溶液加入3.2mg SMCC-PE。用铝包裹并在室温下旋转1小时。

2.准备10 mg NEM在1 mL DMSO中的溶液。

3.每mg IgG向IgG溶液中加入34μg。再次包裹铝并在室温下旋转20分钟。

4.可以将终溶液透析或在柱上运行到合适的缓冲液中。

注意：不要冻结结合物。