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酶联免疫吸附实验 ELISA
  • 发布日期:2019-05-31      浏览次数:301
    • 酶联免疫吸附实验 ELISA

       

       ELISA原理 --操作规则(新手适用)

      酶联免疫吸附实验 ELISA

       

          ELISA法是免疫诊断中的一项新技术,现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定,根据已经使用的结果,认为ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。不仅适用于临床标本的检查,而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本,因此,也适合于血清流行病学调查。本法不仅可以用来测定抗体,而且也可用于测定体液中的循环抗原,所以也是一种早期诊断的良好方法。因此ELISA法在生物医学各领域的应用范围日益扩大,可概括四个方面: 1、免疫酶染色各种细胞内成份的定位。 2、研究抗酶抗体的合成。 3、显现微量的免疫沉淀反应。 4、定量检测体液中抗原或抗体成份。

       一.实验原理

           酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,ELISA过程包括抗原抗体吸附在固相载体上称为包被,加待测抗体抗原), 再加相应酶标记抗体抗原),生成抗原抗体)--待测抗体抗原)--酶标记抗体的复合物,再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体抗原的量。待测抗体抗原的定量与有色产物成正比。

          用于免疫酶技术的酶有很多,如过氧化物酶,碱性磷酸酯酶,β-D-半乳糖苷酶,葡萄糖氧化酶,碳酸酐酶,乙酰胆碱酯酶,6-磷酸葡萄糖脱氧酶等。常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶,碱性磷酸酯酶等,其中尤以辣根过氧化物酶为多。由于酶摧化的是氧化还原反应,在呈色后须立刻测定,否则空气中的氧化作用使颜色加深,无法准确地定量。

           辣根过氧化物酶(HRP)是一种糖蛋白,每个分子含有一个氯化血红素(protonhemin)区作辅基。酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。氯化血红素辅基的大吸收峰是403nmHRP酶蛋白的大吸收峰是275nm,所以酶的浓度和纯度计算式是(已知HRPA(1cm 403nm 1%)25,式中1%指HRP百分浓度为100ml含酶蛋白1g,即10mg/ml,所以,酶浓度以 mg/ml 计算是HRPA(1cm 403nm mg/ml=2.5)HRP纯度(RZ)=A403nm/A275nm纯度RZ(Reinheit Zahl)值越大说明酶内所含杂质越少。高纯度HRPRZ值在3.0左右,高可达3.4。用于ELISA检测的HRPRZ值要求在3.0以上。

       

         ELISA的基本原理有三条:

          1)抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面,可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附,并保持其免疫学活性;
          2)抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物,而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性; 

        (3)酶结合物与相应抗原或抗体结合后,可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在,而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的,因此,可以按底物显色的程度显示试验结果。

       

      二、实验方法

          基本方法一 用于检测未知抗原的双抗体夹心法:
        1. 包被:用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为110μgml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml4℃过夜。次日,弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗3次,每次3分钟。(简称洗涤,下同)。
        2. 加样:加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔,阴性对照孔及阳性对照孔)。
        3. 加酶标抗体:于各反应孔中,加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml37℃孵育0.51小时,洗涤。
        4. 加底物液显色:于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml371030分钟。
        5. 终止反应:于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml
        6. 结果判定:可于白色背景上,直接用肉眼观察结果:反应孔内颜色越深,阳性程度越强,阴性反应为无色或极浅,依据所呈颜色的深浅,以“+”、“-”号表示。也可测O·D值:在ELISA检测仪上,于450nm(若以ABTS显色,则410nm)处,以空白对照孔调零后测各孔O·D值,若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍,即为阳性。

         基本方法二 用于检测未知抗体的间接法:
          用包被缓冲液将已知抗原稀释至110μgml, 每孔加0.1ml4℃过夜。次日洗涤3次。
          加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中,37℃孵育1小时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)
          于反应孔中,加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml37℃孵育30-60分钟,洗涤,后一遍用DDW洗涤。
          其余步骤同“双抗体夹心法”的456

           (二) 酶与底物

             酶结合物是酶与抗体或抗原半抗原在交联剂作用下联结的产物。是ELISA成败的关键试剂,它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应,还具有酶促反应,显示出生物放大作用,但不同的酶选用不同的底物。

      免疫技术常用的酶及其底物

      底物

      显色反应

      测定波长

      辣根过氧化物酶

      邻苯二胺

      橘红色

      492*

      四甲替联苯胺

      黄色

      460**

      氨基水杨酸

      棕色

      449

      邻联苯甲安

      兰色

      425

      2,2'-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐

      蓝绿色

      642

      碱性磷酸酯酶

      4-硝基酚磷酸盐(PNP)

      黄色

      400

      萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐

      红色

      500

      葡萄糖氧化酶

      ABTS+HRP+葡萄糖

      黄色

      405,420

      葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰

      深蓝色

      β-D-半乳糖苷酶

      甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)

      荧光

      360,450

      硝基酚半乳糖苷(ONPG)

      黄色

      420

       

           *  终止剂为2mol/L H2SO4

           ** 终止剂为2 mol/L柠檬酸, 不同的底物有不同的终止剂。

           可催化下列反应: HRP+H2O2→复合物 复合物+AH2→过氧化物酶+H2O+A AH2 ——为无色底物供氢体; A—— 为有色产物。

       

        (三) ELISA常用的四种方法

       

         1直接法测定抗原

            将抗原吸附在载体表面;

            加酶标抗体,形成抗原—抗体复合物;

            加底物。底物的降解量=抗原量。

       

         2间接法测定抗体

           将抗原吸附于固相载体表面;

            加抗体形成抗原-抗体复合物;

            加酶标抗体;

            加底物。 测定底物的降解量=抗体量。

       

         3双抗体夹心法测定抗原

           将抗原免疫种动物获得的抗体吸附于固相表面;

           加抗原,形成抗原-抗体复合物;

           加抗原免疫第二种动物获得的抗体,形成抗体抗原抗体复合物;

           加酶标抗抗体第二种动物抗体的抗体);

           加底物。底物的降解量=抗原量。

         4. 竞争法测定抗原

           将抗体吸附在固相载体表面;

           (1) 加入酶标抗原;

           (2),(3)加入酶标抗原和待测抗原;

           加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差=未知抗原量。

       

      三.仪器和材料

          1. 聚苯乙烯微量细胞培养板-酶标板平板, 40孔, 96

          2. 酶联免疫检测仪,50ul100ul加样器。

          3. 辣根过氧化物酶羊抗兔IgG, 工作稀释度1:1000

          4. 包被液:0.05mol/L PH9.6碳酸盐缓冲液,4℃保存。 Na2CO3 0.159克, NaHCO3 0.293克,蒸馏水稀释至100 ml。

           5. 稀释液:同洗涤缓冲液。 【或者牛血清白蛋白(BSA)0.1g加入洗涤缓冲液至100ml;或者加羊/兔血清与洗涤液配成5-10%

           6. 洗涤缓冲液:0.01mol/L PH7.4  PBS-Tween-20, 4℃保存。 NaCl 8g, KH2PO4 0.2g, Na2HPO4·12H2O 2.9g, Tween-20(0.05%)0.5ml。蒸馏水加至1000ml。

           7. 封闭液:0.5%鸡卵清蛋白,pH7.4 PBS

           8. 邻苯二胺溶液底物:临用前配制, 0.1M 柠檬酸(2.1g/100ml)6.1ml,  0.2M Na2HPO4·12H2O( 7 .163g/100ml)6.4ml, 蒸馏水12.5ml, 邻苯二胺10mg, 溶解后, 临用前加30%H2O2 40ul

           9. 终止液:2mol/L H2SO4。 蒸馏水178.3ml逐滴加入浓硫酸(98%)21.7ml。

       

      .  操作步骤

          1. 包被抗原:用包被液将抗原作适当稀释一般为110微克/孔,每孔加200微升,37℃温育1小时后,4℃冰箱放置1618小时。

          2. 洗涤:倒尽板孔中液体,加满洗涤液,静放三分钟,反复三次,后将反应板倒置在吸水纸上,使孔中洗涤液流尽。

         3. 加封闭液200微升,37℃放置一小时。

         4. 洗涤同2

         5. 加被检血清:用稀释液将被检血清作几种稀释,,每孔200微升。同时作稀释液对照。37℃放置2小时。

         6. 洗涤同2

         7. 加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG, 每孔200微升放置37 1小时。

         8. 洗涤同2

         9. 加底物:邻苯二胺溶液加200ml,室温暗处10--15分钟。

         10. 加终止液:每孔50微升。

         11. 观察结果:用酶联免疫检测仪记录490nm读数。

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