步骤 1：上样

润洗后的内管放入全新收集外管，移液枪缓慢加样品，枪头严禁戳碰滤膜，液面不超最大刻度。

步骤 2：配平离心（重中之重）

1. 天平配平，对称放入转子；角转子：滤膜面朝上摆放；水平转子无朝向要求。

2. 盖紧全套管盖，按厂家推荐离心力：

1. 4 mL/15 mL 大容量：3000–5000 × g

2. 0.5 mL 微量超滤管：8000–12000 × g 严禁超过管壁标注最大 RCF，高速会撕碎滤膜、蛋白变性。

3. 分段离心：每次 10–15 min，取出观察截留液体积，禁止一次性长时间离心干膜。

步骤 3：脱盐 / 缓冲液置换（可选）

1. 样品浓缩至 100–200 μL；

2. 加入足量新目标缓冲液（体积为截留液 5–10 倍）；

3. 重复离心浓缩；循环 2–4 次，可置换 95% 以上原有缓冲盐离子。

步骤 4：样品回收（两种方法）

方法 1：移液吸取（常规）

冰上操作，枪头沿管壁伸入液面，轻柔吹打管壁侧残留蛋白，不触碰底部滤膜，全部吸出截留液。微量样品可用少量缓冲液润洗管壁二次回收。

方法 2：倒置离心（高回收率，微量样品推荐）

丢弃收集管滤液，将内管倒置套入新 EP 管，1000×g 低速离心 1–2 min，膜面截留样品全部被甩出，回收率＞90%。

关键注意事项

1. 绝对禁止干膜 液体透过、滤膜干燥会导致蛋白不可逆吸附，样品大量损失；多次短离心观察体积。

2. 禁止枪头、吸头刮擦滤膜 膜破损会造成大分子全部穿透，实验报废。

3. 一次性超滤管不建议重复使用 同一种样品短期复用可纯水冲洗 + 20% 乙醇浸泡；交叉样品严禁复用，残留污染。

4. 化学兼容性 避免高浓度强碱、强氧化剂、高有机相长时间接触膜；含 SDS 高浓度去污剂会破坏 PES 膜。

5. 无菌操作 细胞、病毒、无菌蛋白样品全程超净台操作，缓冲液提前 0.22 μm 除菌过滤。